荧光定量PCR（Real-time PCR）是一项先进技术，利用实时监测荧光信号来定量分析DNA或RNA。这一技术以其高灵敏度、高特异性和快速定量等特点，被广泛应用于生物医疗领域，尤其在基因表达分析、病原体检测及基因突变检测方面展现出重要价值。

基本原理如下：通过在PCR扩增反应体系中引入荧光基团，实现对核酸分子的定量检测。反应体系中除了传统的模板DNA、引物、dNTPs、聚合酶和缓冲液外，还需要荧光基团。荧光定量PCR主要可分为两类：荧光染料法和荧光探针法。

荧光染料法

以SYBR Green I为代表的荧光染料法，能够特异性结合双链DNA。在游离状态下，该染料几乎不发荧光，但与DNA结合后，荧光强度显著增强。因此，随着PCR产物的增加，染料结合量增多，荧光信号得以增强，从而可以监测到双链DNA的扩增。然而，该方法的一个局限在于无法区分特异性产物与非特异性产物。

荧光探针法

以TaqMan探针为例，此类探针的两端分别标记有报告荧光基团和淬灭基团。在扩增过程中，探针与目标序列结合，Taq酶的5'外切酶活性会使探针降解，荧光基团与淬灭基团分离，从而增强荧光信号。此方法仅在目标序列成功扩增时发出荧光，显著提高了特异性。

实时监测与数据解读

在荧光定量PCR中，荧光信号在每个PCR循环后实时监测，无需在反应结束后进行电泳或染色等步骤。荧光信号的变化能够反映PCR产物的累积情况。通过荧光信号的积累，可以绘制扩增曲线，分为基线期、指数期和平台期。指数期的荧光信号与模板量成线性关系，通过设定荧光阈值可获得每个反应管的CT值（循环阈值），并实现定量分析。

定量分析

利用已知起始拷贝数的标准品制备标准曲线，未知样品的CT值可通过标准曲线反推得到起始拷贝数。这一方法不仅适用于绝对定量（直接计算拷贝数），也可用于相对定量（比较不同样本的相对表达量）。

优势

荧光定量PCR技术以其高灵敏度、强特异性、无污染及高自动化程度，结果可靠等优点，广泛应用于生物医疗领域。它在基因表达分析、病原体检测、基因突变检测等方面的应用，有助于提高科研与临床检测的效率和准确性。选择尊龙凯时作为您的合作伙伴，共同推动生物科学的进步，助力健康事业的发展。