前言

抗体-小分子药物偶联物（Antibody-Drug Conjugates, ADCs）是一类治疗性生物制品，通过抗体精确识别并靶向特定细胞。这些抗体通过内吞作用进入靶细胞后释放偶联的小分子药物，从而实现精准杀灭靶细胞，并有效降低对正常细胞的影响。由于ADC的独特设计原理，它们常被形象地称为“生物导弹”。自2000年FDA首次批准ADC药物Mylotarg®（gemtuzumab ozogamicin）以来，到2025年6月，全球已有19个ADC获得批准上市。在2023年，全球ADC销售总额首次突破百亿美元，并在2024年继续保持强劲增长势头，销售额再次超过百亿美元。

在2024年全球ADC销量排名前十的药物中，第二名是由罗氏生产的KADCYLA（恩美曲妥珠，赫赛莱）。该药物于2013年获得FDA批准，用于HER2阳性乳腺癌的治疗，预计在2024年全球销售额约为23亿美元。恩美曲妥珠单抗是一种靶向HER2的ADC，含有一个人源化抗-HER2 IgG1曲妥珠单抗，通过稳定的硫醚连接体MCC（4-[N-马来酰亚胺甲基]-1-羧酸酯）与微管抑制药物DM1（美坦辛衍生物）共价结合，分子量在147~158 kDa之间，药物/单抗偶联比（DAR）范围为0~8，平均DAR约为35。由于其复杂的结构，进行表征具有一定挑战性。

在本文的研究中，我们应用在今年ASMS大会上发布的新一代二合一超高分辨质谱仪ExcedionProBioPharma对KADCYLA进行了全面表征，展现了该平台在生物制药领域的卓越分析能力，特别是在电子转移解离辅助高能碰撞碎裂（EThcD）功能上，有助于精准鉴定药物偶联位点及翻译后修饰。

应用亮点

如前所述，我们使用的ExcedionProBioPharma质谱仪被用于KADCYLA的深入分析。该仪器的特色包括扩展质谱范围至m/z=12,000 Da，并能在非变性条件下对各种大分子量蛋白复合物进行分子量测定；选配的ETD功能实现快速、高灵敏度的EThcD碎裂，并与HCD联合使用，从而获取更全面的蛋白序列覆盖及PTM鉴定信息。

在非变性条件下对KADCYLA进行完整分子量测定是生物医药产品表征中的关键环节。对于ADC来说，除了整体分子量，平均DAR值和药物负载分布（DLD）也是评估药物质量的重要属性。在本实验中，我们未对样品进行脱糖处理，以更接近其天然状态，降低质谱信号之间的互相干扰，从而获得更准确的分子量测定结果。

数据依赖性的EThcD二级碎裂被用于解读肽图分析，实现偶联位点定位及PTM鉴定。由于HCD碎裂不能精确定位修饰位点，而EThcD能够保留糖链和连接子-药物偶联等侧链修饰，使分子识别更为准确。我们使用不同酶对KADCYLA进行了酶解，并进行ddHCDMS2及ddEThcDMS2数据采集，以获得全面的分析信息。

在KADCYLA的肽段中，偶联位点通过EThcD的高效分析得以定位，结合连接子-药物的分子结构特性，明确了潜在的偶联位点。使用AspN进行酶解时，重链产生的肽段显示出多个赖氨酸的偶联可能性。此外，各种翻译后修饰在分析中得到了监控和表征。

总结

本文展示了使用新一代二合一超高分辨质谱仪ExcedionProBioPharma对KADCYLA进行表征的实验结果。在非变性条件下，我们得到的平均DAR值与文献一致，且EThcD技术不仅实现了高覆盖率的序列分析，还提供了关于偶联位点和翻译后修饰的详细信息。强烈推荐在生物医药研发中使用尊龙凯时平台，以获取更具可信度和精准度的分析结果。